AmyJet 傾心推薦IP專用二抗

發布者:艾美捷科技發布時間:2020-01-14

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       免疫沉淀 (Immunoprecipitation,IP) 是利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后,再與ProteinA/G偶聯的agarose或Sepharose珠子孵育,通過離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白復合物,沉淀經過洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。


       在免疫沉淀實驗后的WB驗證環節中,當使用常規的 Anti-IgG (H+L) 酶標二抗時,通常會出現對應免疫沉淀一抗變性后產生的重鏈(50kDa)和輕鏈(25kDa)兩條帶。如果檢測的目的蛋白分子量在此附近時,就會受到這兩條帶的干擾。

 

免疫沉淀

 

        如何避免IP檢測過程中的重、輕鏈干擾,AmyJet可為您提供兩種方案:

 

        方案一:選擇WB一抗時,選擇和IP用一抗不同的種屬,避免IP一抗的干擾

 

IP捕獲抗體類型 WB檢測時一抗類型 WB檢測時二抗類型 備注說明
小鼠單抗/多抗 兔多抗 HRP-標記抗兔IgG二抗 由于 IP 捕獲抗體與 WB 檢測一抗屬于不同種屬來源抗體,故WB 檢測時使用 HRP-標記抗兔 IgG 二抗可以有效避免重鏈輕鏈信號的影響。
兔多抗 小鼠單抗 HRP-標記抗小鼠IgG二抗 由于IP捕獲抗體與WB檢測一抗屬于不同種屬來源抗體,故WB檢測時使用HRP-標記抗小鼠IgG二抗可以有效避免重鏈輕鏈信號的影響。
小鼠多抗

 

貨號 名稱 應用類型
AMJ-AB2003 山羊抗兔IgG二抗,HRP標記 WB,IHC,ELISA
AMJ-AB2002 山羊抗小鼠IgG二抗,HRP標記 WB,IHC,ELISA

 

       方案二:選擇只和重鏈或輕鏈反應的二抗

 

       如果目標蛋白分子量小于30KD,為了避免抗體輕鏈的干擾,選擇重鏈特異性二抗;如果目標蛋白分子量大于30KD,為了避免抗體重鏈的干擾,選擇輕鏈特異性二抗。

 

類型 貨號 名稱 應用類型
無重鏈干擾 AMJ-AB2016 IP™ 山羊抗小鼠IgG輕鏈二抗,HRP標記 WB,IP
AMJ-AB2017 IP™ 小鼠抗兔IgG輕鏈二抗,HRP標記 WB,IP
無輕鏈干擾 AMJ-AB2018 IP™ 山羊抗小鼠IgG重鏈二抗,HRP標記 WB,IP
AMJ-AB2019 IP™ 山羊抗兔IgG重鏈二抗,HRP標記 WB,IP

 

重鏈或輕鏈反應二抗

        IP實驗常見問題匯總:

 

結果 原因 解析
顯影信號整體很弱,熒光信號淬滅 顯影液失效 通過檢查顯影液清澈度初判,并通過立即更換新顯影液后再曝
底物失效 將PVDF膜重新TBST略洗幾次,重新加合格的底物
二抗孵育過多 如果操作較快,會出現第1張膠片曝光后信號極強,而第2張起可能信號淬滅;如果操作稍慢點,甚至第1張膠片起信號基本淬滅,這種情況建議重做,降低二抗濃度、減少孵育時間
條帶正確,但顯影過強或過弱 上樣量過大 可減小上樣量、提高一抗稀釋度并縮短曝光時間
上樣量過小 可增加上樣量、降低一抗稀釋度并延長曝光時間
背景雜亂厚重,大片“黑區”,導致無法分析 一抗孵育時間過長
或濃度過高
4℃封閉過夜,一抗孵育1 hr,并可適當增加洗膜時間
Input泳道無目的帶,而IP泳道有 目的蛋白豐度不高,無法直接 Western blot 檢出,而 IP 能進行濃縮富集
Input泳道有目的帶,而IP泳道無 該種一抗主要識別和結合靶蛋白內部的線性表位、而非暴露在外表的的線性或空間表位,故IP制樣時無法有效捕獲住組織或細胞中的完整結構靶蛋白
該蛋白濃度極低,導致捕獲過程不僅未起到富集作用,反而因為洗滌操作,使靶蛋白損失殆盡,最后幾乎無靶蛋白被洗脫下來;或lysis buffer過強;或選用了不正確的beads; 或一抗亞型為 IgM 或 IgA

 

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